Вопрос № 18. Методы выделения чистой культуры.

Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха).

Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ).
Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или в 0,85 %-ом растворе NaCl (физиологическом растворе). В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.
Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды – это первое разведение (10-1). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 мл суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение (10-2). Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.
Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расправленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 – 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушить для удаления конденсационной воды, например поместив чашки в термостат на 2 – 3 суток крышками вниз. 
В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную поверхность проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2 – 4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпателем. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45 – 50 0С среду, тщательно перемешивают, затем немедленно выливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2 -4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15 – 20 мл среды, расплавленной и остуженной до 45 – 50 0С, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.
Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего учета колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендуется осветлять. Определение численности строгих анаэробов требует применения техники Р. Хангейта.
Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1 – 15 сут инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.
Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 – 50 до 100 – 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле M=a*10n/V, 
Где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V – объем суспензии, взятый для посева, мл; 10n – коэффициент разведения.

Вопрос № 19. Микроорганизмы почвы.

М/о играют большую роль в почвообразовательных процессах. Процессы разрушения минералов и превращения горной породы в почву происходят при самом непосредственном участии живых организмов. Кроме бактериальной флоры, занимающей ведущее место в этих процессах, почвы богато населены водорослями, грибами и простейшими, которые также имеют большое значение в процессе создания почвенного плодородия.

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от площади и микрорельефа (ровный, волнистый, склон и т.д.). Рекомендуется с площади 100 м2 брать пробу из трех точек, более 100 м2 – из пяти, с гектара и более – из 15. при исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний двухсантиметровый слой, при изучении микрофлоры почвенного профиля – по горизонтам (снизу вверх).
Почвенный образец берут стерильным буром, стерильной лопатой и стерильным ножом в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной ватой, или в стерильные полиэтиленовые мешки, или в мешки из пергаментной бумаги. На пакеты или банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, горизонта и других необходимых сведений. 
Бур, лопату и нож в поле перед взятием образца тщательно очищают, затем обжигают горящим спиртом.
Почвенные образцы анализируют в первые сутки. В случае необходимости допускается хранение их в холодном помещении (в холодильнике) в течение 2 дней. Для большей однородности среднего образца, соблюдая все условия асептики, его тщательно перемешивают, вынимают корни растений, различные включения (камни).
Хорошо перемешанную почву высыпают на сухое стекло, протертое спиртом и обожженное пламенем грелки. Почву тщательно перемешивают шпателем и раскладывают ровным слоем. Пользуясь пинцетом, удаляют корешки и другие посторонние включения. Непосредственно перед работой шпатель и пинцет прокаливают в пламени и слегка остужают на воздухе. Из разных мест распределенной на стекле почвы шпателем отбирают небольшие порции и в стерильной, предварительно тарированной фарфоровой чашке взвешивают на технических весах 1 г среднего образца.
Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток м/о с почвенных частиц пробу подвергают специальной обработке. Заранее готовят 2 стерильные колбы емкостью до 250 мл: одну со 100 мл водопроводной воды, другую оставляют пустой. Берут из первой колбы 0,4 – 0,8 мл воды, увлажняют ею навеску почвы и смесь растирают 5 минут стерильным резиновым пестиком или пальцем в резиновой стерильной перчатке. Стерильной водой из первой колбы переносят растертую почвенную массу в пустую колбу, используя для этого весь объем воды. Почву растирают и переносят в колбу около пламени горелки. Колбу с почвенной суспензией встряхивают в течение 5 минут. После этого суспензии дают отстояться 30 с, чтобы осели крупные частицы, и тотчас же используют ее для приготовления препарата или разведений. При этом учитывают, что в полученной исходной суспензии исследуемый материал (почва) разведен в 100 раз.
Готовят разведения почвенной суспензии 1:103, 1:104, 1:105. производят посев в чашки петри из полученных разведений. Объем посевного материала – 0,05 мл. чашки петри ставят в термостат и культивируют в течение 6 – 7 суток при температуре 28 – 300С. По окончании срока культивирования подсчитывают количество выросших колоний и определяют наиболее вероятное число микроорганизмов в 1 г почвы.
Вопрос № 20. Микроорганизмы воздуха.
Качественный и количественный состав микрофлоры воздуха зависит, с одной стороны, от источника его заражения, с другой стороны, от тех условий, которые ведут к накоплению пыли и способствуют поступлению ее вместе с микрофлорой в воздух.
Воздух помещений содержит преимущественно витающую пыль, атмосферный же воздух, то есть воздух с улиц и так далее, кроме витающей пыли, в значительной степени обогащен оседающей пылью.
Санитарно – гигиеническое исследование воздуха включает определение общего количества микробов в 1 м3.
Воздух жилых помещений считается чистым, если содержит м/ов в 1 м3 4500 в зимнее время и менее 1500 в летнее время. Загрязненный воздух содержит в 1 м2 соответственно более 7000 и более 2500 микроорганизмов.
В воздухе обнаруживаются самые различные виды бактерий, которые находятся во взвешенном состоянии: кокковые формы, сарцины, спороносные аэробные бактерии, конидии и споры различных грибов, а также дрожжеподобные грибы.
В зависимости от задач исследования применяют различные методы учета воздушной микрофлоры.
Пробы воздуха отбирают седиментационным (чашечным) или аспирационным методом. Последний основан на ударном действии воздушной струи о поверхность питательной среды.
Чашку петри с плотной питательной средой устанавливают в открытом виде на разном расстоянии от пола на 5, 10, 15, 20 минут. Затем чашку закрывают, переносят в термостат и инкубируют при 300С. В период инкубации из каждой осевшей клетки в результате ее размножения образуется обособленная колония. Производят подсчет колоний и изучают характер микрофлоры. Таким образом, подсчитанное количество выросших колоний будет соответствовать количество м/о, осевших из воздуха за данный промежуток времени.
При учете плесневых грибов и дрожжей в качестве питат среды обычно используется сусло-агар, а для бактерий – МПА. Инкубация длится в течение 3-5 суток. При этом учитываются не все бактерии, а только сапрофитные, то етсь способные расти на питательных субстратах органического происхождения. Строгие анаэробы при этом не выявляются.
На площадь 100 см2 оседает за 5 минут примерно столько м/о, сколько их содержится в 10 литрах воздуха. Однако с помощью более точных приборов было определено, что эти показатели занижены в 3 раза. Следовательно, можно считать, что число микробов, выросшие после 5 минутной экспозиции при последующем культивировании соответствует содержанию микробов не в 10, а в 3 –х литрах воздуха.
Для подсчета микробного числа воздуха в начале определяют площадь чашки петри, которая использовалась для опыта, а затем подсчитывают количество выросших колоний.
S=П*r2=3,14*4,52=63,3см
В 63,6*3/100=1,9
1,9-35микробов

1000л-х

Вопрос № 21. Микроорганизмы воды.

Водоемы содержат большое количество м/о: чистые воды рек – 10-10000, в загрязненных реках они исчисляются миллионами и даже миллиардами в мл. 

Среди них находятся м/о, постоянно проживающие в водоемах, а также попадающие туда с осадками, сточными водами и др загрязнениями. В воде встречаются представители самых разнообразных групп микробов – бактерии, актиномицеты, дрожжи, микромицеты, простейшие и водоросли. Количество и видовой состав микрофлоры воды в значительной степени зависит от условий среды, то есть от наличия питательных веществ, температуры, аэрации, окислительно-восстановит-х условий, рН и р.; а также от веществ, поступающих в водоемы.
При изучении водной микрофлоры используют методы общего учета микробных тел, определяют основные биологич группы, а также выявляют представителей специфической микрофлоры и определяют видовой состав.
Большое значение для здоровья населения имеет санитарно-биологич надзор за состоянием водоемов, поскольку возбудители таких инфекций, как брюшной тиф, дезентерия, халера и другие способны не только сохраняться в воде, но и размножаться в ней.
Присутствие в воде большого количества сапрофитов, способных развиваться на МПД и МПА, указывают на поступление в водоем органич веществ. Обнаружение же бактерий, встречающихся в кишечнике человека и жив-х, свидетельствует о загрязнении воды фекальными массами и разл отбросами. Общепризнанным показателем фекального сброса воды явл кишечная палочка (E. coli и родственные ей организмы).
Присутствие этих бактерий в воде указывает на возможность нахождения в воде и таких патогенных бактерий, как возбудители тифа, паротифов, холеры и др.
Прямое определение патогенных форм в воде представляет большие затруднения, поэтому для выяснения санитарного состояния водоемов пользуются косвенными показателями загрязнения воды болезнетворными микробами, то есть определением содержания в воде бактерий группы кишечной палочки.
Представители этой группы обладают след общими св-ми:
-короткие грамотрицат палочки, не образующие спор, 
-аэробы или факультативные анаэробы, 
-сбражживают при 430С глюкозу с образованием кислот, 
-на фуксино-сульфитном агаре образуют колонии с красным металлич блеском, темно-красные и розовые.
Для выявления кишечной палочки и родственных ей бактерий используют спец методики.
Количественный учет различных физиологич групп м/о производят путем высева определенных объемов воды на плотные или же жидкие элективные среды. При этом случае в загрязненных водоемах используются методы предельных разведений.
Сущность метода заключается в высеве опреленного объема исследуемой суспензии (водопров вода, пробы открытых водоемов и т д) на плотную среду в чашки петри и последующем подсчете выросших колоний. Принято считать, что каждая колония – потомство одной клетки. 
Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или в 0,85 %-ом растворе NaCl (физиологическом растворе). В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.
Число м/о в 1 мл суспензии
N=X/n*K*1/V
Х-общее количество колоний при высеве данного разведения
n-число повторностей
V-объем суспензии, взятый для посева
K-разведение, из которого произведен посев.

[Вопросы][1-6][ 7-11][12-17][18-21]